Profesor Hershel Layton — arkeolog terkenal, pemecah teka-teki, dan pria luar biasa — dan calon magang muda Luke Triton menerima surat misterius dari mantan muridnya Janice Quatlane yang berisi tiket ke opera di Crown Petone. Mereka segera menemukan bahwa itu bukan opera biasa, tetapi lebih merupakan permainan licik untuk Mata Air Pemuda yang legendaris — pemberi kehidupan kekal. Namun, ini hanya menggores permukaan misteri yang sedang berlangsung yang harus dipecahkan pasangan tersebut untuk bertahan hidup. Meskipun dihadapkan dengan teka-teki yang kompleks dan persaingan yang ketat, Profesor Layton dan asistennya yang terpercaya Luke tidak pernah lupa untuk menjunjung standar para pria sejati … dan seorang pria sejati tidak pernah meninggalkan teka-teki yang tidak terpecahkan.